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Home クローニング操作

プロトコルID: PC021

PCR産物のA塩基の突出末端の生成を利用して、T-Vectorとともにクローニングを行います。

以下のインシリコ実験には、IMCを使用します。


インシリコ試薬・装置


  1. ゲノム塩基配列ファイル(*) :例 (Bsub50kb.gbk)
  2. ベクター塩基配列:例 pColdII.gbk(**) :
  3. Primer Set(**) :
  4. 制限酵素: 例 (EcoRV)
  5. IMC SE/GE/AE
  • *塩基配列は、インシリコバイオロジー社のサイトからダウンロード可能です
  • **制限酵素はIMCに標準で登録されているものが使用できます
  • ***例はIMCのサンプルファイルに入っています

インシリコ実験方法


まず、T-ベクターを作成します。

  1. 環状のベクター塩基配列(pColdII.gbk)をIMCに読み込みます。
  2. 制限酵素ボタンをクリックします。制限酵素(EcoRV)にチェックをつけます。
  3. 「Show Recognition Site」ボタンをクリックし、EcoRVの認識部位を確認します。
  4. EcoRVの認識サイトが1箇所だけ確認されたので、そのまま「Digestion」を実行します。
  5. その結果直鎖状となったDNAアイコンをクリックして、その末端を調べます。
    • 平滑末端であることがわかります。
  6. この平滑末端の3’側にT塩基を1塩基分付加します。このためには、「T塩基付加ボタン」をクリックします。
  7. 再び、両末端の形状を調べます。
    1. 両端の3’側にTが1塩基付加されていることがわかります。

これで、T-Vectorが作成されました。

次に、ゲノムDNAの一部領域をPCRで増幅します。

  1. 枯草菌由来のゲノムDNA(Bsub_50kb.gbk)(人工的に環状にしたもの)をIMCに読み込みます。
  2. 上記のゲノムフィーチャーマップの任意の領域をマウスでドラッグします。
    • ドラッグ範囲がカラー(ピンク)で表示されます。
  3. このカラー化された領域でマウスを右クリックします。
    • ポップアップメニューが表示されるので、
  4. 「PCR Primer Design」を選びます。
    • 「PCR Primer Design」ダイアログが表示されます。
  5. とりあえずデフォールトのまま何も指定しないで、ダイアログ下部の「Set」ボタンをクリックします。
    • 「Primer List」ダイアログが表示されます。
    • (最適なプライマーがない場合はプライマーが見つからないとのメッセージが表示される場合がありますので、PCRの条件を変えて再実行します)。
  6. 「Primer List」ダイアログの左下に「Add A-Base to both 3’ ends」というチェックボックスがあるので、チェックを入れます。
    • (チェックなしに実行すると、平滑末端のPCR産物が生成されてしまいます)。
  7. なるべくリストの上位のプライマーセット1つにチェックをつけ、「Amplify」ボタンをクリックします。
    • PCR処理が実行され、最初にPriming Sitesが検出されます。
  8. 生成されたPCR産物をLOADし、そのアイコンをクリックします。
  9. そして、両端の形状を調べます。

さて、いよいよライゲーションです。

  1. ライゲーションボタンをクリックします。直鎖状化され、T塩基を付加したベクターと、PCRで増幅された産物をライゲーションします。2つのファイルを選択し、「Legation」ボタンをクリックします。2つの産物が表示されるので、2つともチェックし、LOADします。
  2. それらの産物のアイコンが環状であることを確認し、1つ1つクリックして、フィーチャーマップを表示します。
  3. さらに、「Plasmid Map」ボタンをクリックし、インサートされたPCR産物を選び、プラスミドマップを描画します。

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