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Home クローニング操作

Protocol in silico: PC009: プライマーへの制限酵素認識配列付加


プライマー配列に制限酵素認識配列を付加します。2本鎖の未消化完全配列を付加します。

以下のインシリコ実験には、IMCを使用します


試薬・装置


1.全ゲノム断片塩基配列ファイル(*、**):例(Bsub_50kbL.gbk)

2.制限酵素(EcoRI)

3.実行ソフトウェア:IMCSE/GE/AE

*DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です。

**例はインストール時のサンプルに含まれています。isb/imc/samples


方法


1.塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから微生物全ゲノムDNA塩基配列(Bsub_50kbL.gbk)をIMCに読み込みます。

2.IMCメイン画面左側の反応チューブに円形あるいは線形のDNAアイコンが表示されます。

3.ズームアウトボタンを何回かクリックすると以下と同様のマップが見えてきます。

4.制限酵素認識配列付加ボタンをクリックします。

5.すると右のような、制限酵素選択ダイアログが表示されます。

6.1で読み込んだDNA断片の5’末端にEcoRIサイトを、3’末端にHindIIIサイトを付加するために、2つの制限酵素を探します。両方とも6塩基認識酵素で、Palindromicなので、それぞれ6bpとPalindromicにチェックを入れます。すろと、その条件に一致する制限酵素だけがリストされます。

7.スクロールさせて、EcoRIを見つけます。EcoRIの5‘チェックボックスにチェックを入れます。さらに、HindIIIの3’チェックボックスにチェックを入れます。

8.ここで、下部のAdd Enzyme siteボタン をクリックします。すると左の確認メッセージが表示されるので、Yesを応えます。

9.フィーチャーマップに表示されている塩基配列の両末端をみると、それぞれの制限酵素によって切断された突出末端が付加されていることがみられます。この場合、表示上は、両鎖が表示されていますが、5‘あるいは3’のどちらが突出しているかは保存されていますので、このままライゲーション可能です。ブルーの□で囲まれた塩基は本来はありません。


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